荧光显微镜是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。在荧光显微镜上，必须在标本的照明光中，选择出特定波长的激发光，以产生荧光，然后必须在激发光和荧光混合的光线中，单把荧光分离出来以供观察。因此，在选择特定波长中，滤光片系统，成为极其重要的角色。荧光显微镜广泛应用于生物，医学等领域。  

图1. 荧光显微镜

一、荧光显微镜主要组成：  

(A)光源：光源幅射出各种波长的光(从紫外至红外)。  

(B)激发滤光源：透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无用的光。  

(C)荧光标本：一般用荧光色素染色。  

(D)阻挡滤光片：阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射荧光，在荧光中也有部分波长被选择透过。

二、荧光显微镜分类： 

荧光显微镜一般分为透射和落射式两种类型： 

a.透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不使用于非透明的被检物体。  

b.落射式：透射式目前几乎被淘汰，新型的荧光显微镜多为落射式，光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。  

三、荧光镜检术的注意事项  

a.激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。  

b.作油镜观察时，应用"无荧光油"。  

c.荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。  

d.电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。  

四、荧光显微镜的使用

1.荧光显微镜标本制作要求 

a.载玻片 

载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。 

b.盖玻片 

盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涩盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本。 

c.标本 

组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能被充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，影响判断。 

d.封裱剂 

封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在PH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/L PH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。 

e.镜油 

一般用暗视野荧光显微镜和油镜观察标本时，必须使用镜油。最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。 

2.荧光显微镜基本操作 

a.关闭房间内的电灯，开启显微镜汞灯； 

b.根据样品标记的荧光素选择相应的滤光片； 

c.放好样品，找到合适的视野； 

d.如需拍照，请确认照相机内已装好彩色胶卷； 

e.开启自拍装置，选择手动档，通常拍摄速度在0.5-10秒内； 

f.使用结束，关闭所有电源并做好使用记录。 

3.荧光图像的记录方法 

荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。 

荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片即可。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。 

4.使用荧光显微镜的注意事项 

a.严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。 

b.应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。 

c.防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。 

d.检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。 

e.荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。 

f.标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。  

g.荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”指无或可见微弱荧光。“+”指仅能见明确可见的荧光。“++”指可见有明亮的荧光。“+++”指可见耀眼的荧光。